sabato 1 dicembre 2012

LA CONIUGAZIONE E LA MAPPATURA GENICA.


La coniugazione batterica è un processo di trasferimento genico unidirezionale che avviene tra un donatore di DNA e un ricevente, questo processo avviene grazie ad un plasmide definito coniugativo presente nel ceppo batterico donatore.

Il plasmide F e la coniugazione.
Le cellule che portano il plasmide F saranno chiamati semplicemente F+; le cellule senza plasmide saranno chiamate F-.
Il plasmide ha la peculiarità di portare molti geni che saranno utili per permettere il trasferimento del DNA, compresi i geni che codificano per proteine fondamentali per la creazione del cosidetto pilo, grazie al quale la cellula donatrice entra in contatto con la cellula ricevente, inoltre trasporta codifica per endonucleasi, enzimi in grado di poter scindere il DNA dei plasmidi F in siti specifici.
Quando il donatore entra in contatto con il ricevente, grazie al pilo, la ritrazione della stessa struttura avvicina le due cellule.
Il DNA del plasmide F viene tagliato, questo taglio determinerà l'inizio del trasferimento, un singolo filamento si sposterà lungo il ponte tra le due cellule. Il trasferimento del DNA F nel ricevente è, contemporaneamente, accompagnato dalla sintesi nel donatore di un altra copia del filamento di DNA che sta uscendo.
Quando il DNA del donatore entra nella cellula ricevente, riforma un circolo e il ricevente sintetizza il filamento di DNA complementare.
In seguito a questo incrocio il ricevente F- diventa F+ e il donatore rimane F+.
Il plasmide F tramite il processo della coniugazione, agisce come un virus nella popolazione umana, pochi batteri F+ (quindi batteri contenenti il plasmide) se vengono introdotti in una coltura di batteri F-, questi ultimi saranno resi F+ in poco tempo.

Il plasmide F e il batterio Escherichia Coli.
Il cromosoma del batterio E. Coli è disseminato di sequenze nucleotidiche note come sequenze IS (inserzione), il plasmide F a sua volta possiede tre sequenze IS identiche a quelle dell'E.coli, in alcuni casi avviene ricombinazione omologa (crossing over) tra l'elemento IS sul plasmide e sul cromosoma batterico , le cellule in cui i cromosomi portano un plasmide integrato sono note come cellule Hfr torneremo in seguito su queste cellule.

Incroci Hfr x F- e le mappe genetiche.
I geni in un cromosoma Hfr sono trasferiti al ricevente in un ordine riproducibile, i ricercatori compresero che potevano utilizzare gli incroci Hfr per mappare i geni. Per ottenere inormazioni utili i ricercatori analizzarono ceppi che differivano gli uni dagli altri negli alleli di diversi geni.
L'utilizzo di questi ceppi nella mappatura genetica trae vantaggio dal fatto che durante la coniugazione il DNA cromosomico si sposta dal donatore al ricevente ad una velocità costante.

L'esperimento di accoppiaento interrotto.
I ricercatori presero in considerazione i seguenti genotipi:
genotipo Hfr: STRs (sensibile alla streptomicina), THR+ (in grado di sintetizzare l'amminoacido treonina), AZIr (resistente alla sodio azide), TONr (resistente al fago T1), LAC+ (in grado di sintetizzare lattosio come unica fonte di glucosio), GAL+ (in grado di utilizzare il galattosio come unica fonte di carbonio).
Genotipo F-:  STRr (resistente alla streptomicina), THR- ( non sintetizza treonina), AZIs (sensibile alla sodio azide), TONs (sensibile al fago T1), LAC- ( non in grado di usare lattosio), GAL- (non in grado di usare galattosio).

In seguito utilizzarono un terreno di coltura non selettivo che permetteva la crescita di entrambi i ceppi, e stabilendo condizioni che permettevano la coniugazione, In seguito ad intervalli di un minuto si passò le aliquote di miscele d'incrocio furono agitate violentemente in un frullatore da cucina, ritenendo che l'agitazione violenta avrebbe separato coppie di cellule in coniugazione, prima che tutti i geni dal donatore fossero stati trasferiti al ricevente, interrompendo perciò l'incrocio.
In seguito piastrarono i campioni della coniugazione, prima che tutti i geni dal donatore fossero stati trasferiti al ricevente, interrompendo perciò l'incrocio.
SI piastrarono poi i campioni della coniugazione interrotta su capsule di Petri contenenti streptomicina, per uccidere le cellule donatrici originali.
Le piastre erano prive anche di treonina per selezionare a sfavore le cellule F- e THR-, chnon si erano incrociate. Infine, dopo la crescita degli ex coniuganti sulle piastre contenenti streptoicina senza treonina, usarono il replica plating per piastrare ogni colonia di ciascun ex coniugante su terreni selettivi per gli altri quattro marcatori presenti nei ceppi del donatore e del ricevente.
In questo modo riuscirono a determinare quali geni e in che ordine erano stati trasferiti nel ricevente F- prima che venisse interrotta la coniugazione.
Nell'imagine sotto sono mostrate le frequenze dei ceppi ricombinanti contenenti i vari alleli del ceppo donatore.
Le interruzioni sono avvenute prima dopo 8 minuti, una piccola frazione di ricombinanti era AZIr, ma nessuno portava altri alleli del donatore, a 10 minuti qualcuno dei ricombinanti presentava TONr del donatore. Dopo 15 minuti apparivano i primi alleli LAC+ nelle colonie ricombinanti e dopo 17 minuti si osservavano i ricombinanti presenti GAL+. La frequenza di coniuganti che contengono in particolare gene del donatore Hfr aumenta con il tempo, fino a raggiungere un plateu tipico per ciascun gene.
Le percentuali erano 90% AZIr, 80% TONr, 40% LAC+, 20% GAL+.
Quindi la presenza del plasmide F, integrato nel ceppo Hfr, spiega le due caratteristiche specifiche di ciascun gene, rivelate dagli esperimenti di coniugazione interrotta:  1) il tempo impiegato per il trasferimento dell'informazione genica dipende dal fatto che tutte le cellule donatrici portano il plasmide F nello stesso sito, sui loro cromosomi, e tutte iniziano il trasferimento del loro DNA nelle cellule F allo stesso momento e con lo stesso orienamento. In questo modo il tempo impiegato dal primo gene per entrare nella cellula ricevente riflette la distanza di quel gene dall'origine del trasferimento, localizzata nel plasmide F integrato. I primi, pochi donatori HfrH a stabilire una connessione per l'incrocio con un partner F- iniettano il loro allele AZIr da allora in poi-
I primi alleli TONr passano nelle cellule F- dopo circa 10 minuti mentre gli alleli LAC+ dopo circa 15 minuti, e i primi alleli GAL+ dopo circa 17 minuti.
Con l'interruzione della coniugazione, i ricercatori sono riusciti quindi a predire l'ordine dei geni sul cromosoma di E.coli e rende possibile mappare le distanze fra geni, le distanze vengono definite come minuti di trasferimento genico.

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