mercoledì 4 aprile 2012

WESTERN BLOTTING


Il western blotting è una metodica analoga al southern e all'nothern blotting  usata per rilevare una proteina specifica in una miscela complessa che vogliamo analizzare.
  • è un test particolarmente sensibile ed efficace.
  • svantaggi: è molto costoso e poco pratico da applicare
Per prima cosa si deve ottenere un campione della proteina di nostro interesse che si desidera analizzare, ciò lo si può ottnere ad esempio da campioni di cellule. Le cellule vengono opportunamente lisate in modo tale da ottenere il contenuto proteico. In seguito si effettua un elettroforesi su gel in modo tale che le proteine vengano separate in base alle dimensioni. Le proteine devono essere trasferite dal gel su una membrana  di nitrocellulosa usando l'elettricità, il trasferimento non avviene per capillarità come nel caso del southern o del nothern. Questa membrana può quindi essere utilizzata per sondare le proteine di interesse utilizzando un anticorpo.
L'anticorpo ci serve per rilevare la proteina di nostro interesse tra le migliaia di proteine sul gel!
 E' possibile visualizzare la proteina direttamente sulla nitrocellulosa usando un metodo colorimetrico.
In seguito la separazione elettroforetica delle proteine è resa possibile sotto l'influenza di un campo elettrico applicato. La migrazione delle proteine avviene in base al loro peso molecolare; e non si esplica per capillarità come nel nothern o southern blot. Può essere usato l'SDS per denaturare le proteine.

Con il western blot qualsiasi campione di proteine proveniente da tessuti o cellule e le proteine ricombinanti sintetizzate in vitro. L'efficacia del processo dipende anche dal tipo di anticorpo che andiamo ad utilizzare per la proteina di nostro interesse e quanto è specifico per essa. Sono fondamentali ai fini della riuscita di questa tecnica, in quanto l'anticorpo ci permette di distinguere tra le migliaia di proteine presenti nel campione di analisi quella che ci interessa.

Come si può vedere nel disegno illustrativo sotto, nel primo passaggio otteniamo le proteine di nostro interesse, le possiamo prelevare da campioni di cellule per esempio. Le cellule vengono lisate in modo tale da rilasciare le proteine. In seguito le proteine raccolte vengono fatte "correre" sul gel tramite elettroforesi, in modo tale da separarle in base al peso molecolare. Le proteine una volta separate saranno trasferite su una membrana tramite l'utilizzo di elettricità.
Altro elemento essenziale per la riuscita del western blot è la presenza di anticorpi che servirà per rilevare la proteina che ci serve tra le migliaia presenti. Dopo aver utilizzato l'anticorpo primario che ha legato le proteine di nostro interesse, si utilizza in seguito un anticorpo secondario in grado di poter rilevare il primo. Si viene a creare un vero e proprio sandwich (proteina-anticorpo primario-anticorpo secondario). L'anticorpo secondario ha ad esso associato un enzima, in grado di poter catalizzare una reazione in cui un substrato specifico viene poi convertito in un prodotto luminoso.
La luce rilasciata da questo composto viene evidenziata può essere evidenziata come una macchia sulla pellicola; macchia che ci permette di individuare la proteina che stiamo ricercando.




domenica 1 aprile 2012

MOTIVI DI LEGAME ALL'RNA.


Nel post precedente ho accennato ai motivi di legame delle proteine al DNA. Domanda: esistono motivi di legame all'RNA? la risposta è si. Inevitabilmente esistono proteine in grado di legarsi all'RNA, e tali proteine come nel caso di quelle che si legano al DNA hanno specifici motivi che ne permettono un'interazione tra le componenti amminoacidiche delle proteine e i nucleotidi dell'acido nucleico in questione.
I principali, o una parte di tali motivi sono:
  • Il dominio ribonucleoproteico (RNP): comprende quattro foglietti beta e due alfa eliche nell'ordine beta-alfa-beta-beta-alfa-beta. I due foglietti beta centrali formano il legame con la molecola di RNA. Questo dominio è il motivo di legame all'RNA più comune.
  • Il dominio di legame all'RNA a doppio filamento (dsRBD): simile al dominio precedente, ma con una struttura alfa-beta-beta-beta-alfa. La sua funzione di legame al DNA è localizzata tra beta e alfa, alla fine della struttura. Come indica il nome, il motivo si ritrova in proteine che legano l'RNA doppio filamento.
  • Il dominio di omologia k: ha la struttura beta-alfa-alfa-beta-beta-alfa, con la funzione di legame situata tra la coppia di alfa-eliche. Non è molto comune.
  • L'omeodominio: lega il DNA, in alcune proteine può avere anche un attività di legame all'RNA. In particolare, una proteina ribosomale utilizza una struttura simile all'omeodominio per legare l'rRNA e alcune proteine a omeodominio come Bicoid di Drosophila melanogaster in grado di legare entrambi gli acidi nucleici.