sabato 3 aprile 2010

COSMIDI: vettori per frammenti più grandi di DNA.



I cosmidi sono particolari vettori che potremmo definire come un ibrido costituito da fagi λ e plasmidi, in parole povere è un vettore per la clonazione di frammenti di DNA che possiede le caratteristiche dell'uno e dell'altro. Il cosmide è in grado di replicarsi nella cellula come un plasmide ed essere imballato come un fago. Tuttavia, il cosmide può trasportare inserti di DNA che sono circa tre volte più grandi di quelle realizzate dalla particella fagica λ (più grande di circa 45 kb). La chiave nel funzionamento dei cosmidi è che la maggior parte della struttura del fago λ come abbiamo accennato nel post precedente è stato soppresso, ma le sequenze segnale che promuovono l'inserimento del DNA nel capside (siti cos) rimangono. Questa struttura permette di modificare le teste dei fagi la quali possono essere farcite con quasi tutto il DNA del donatore. In questo modo possono essere confezionati nei capsidi usando il sistema di impacchettamento in vitro.
La particella fagica del lambda può ospitare fino a 52 kb di DNA, per cui se dal genoma sono state rimosse le 15 kb facoltative, se ne possono clonare fino a 18 kb di DNA. Questo limite è superiore rispetto a quello dei vettori plasmidici ma è ancora molto piccolo se paragonato ai genomi più grandi. I cosmidi possono essere sfruttati per integrare frammenti di DNA di grandi dimensioni. Cosa hanno di particolare? Possiedono i siti cos di lambda accennati nel post precedente, grazie ad essi è possibile formare dei concatenameri, i quali uniti a livello di tali siti, funzionano da substrati per l'impacchettamento in vitro poichè il sito cos è l'unica porzione del DNA che deve essere riconosciuto come genoma di lamdba dalle proteine che impacchettano il capside e quindi consentire l'inserimento in esso. Il cosmide non può dirigere la sintesi di particelle fagiche, ma si replica come un plasmide.  Il DNA ricombinante si estrae quindi dalle colonie come quando si utlizzano i plasmidi come vettori e non dalle placche come invece accade quando si utilizzano i fagi. Come per gli altri tipi di vettori lambda, il limite superiore di lunghezza del DNA clonato è delimitato dallo spazio disponibile nella particella fagica lambda. Il cosmide in se può avere dimensioni pari o inferiori a 8kb per cui si possono inserire fino a 44 kb di DNA nuovo prima di raggiungere il limite di impacchettamento della particella fagica. Il primo passo in avanti nel tentativo di clonare frammenti di DNA oltre le 50 kb è stato fatto con l'invenzione dei cromosomi artificiali di lievito o YAC. Quesi vettori non vengono propagati in E.Coli bensì in saccaromices cervisea e non si basano si plasmidi o virus, ma su cromosomi. I primi YAC sono stati ideati dopo che lo studio sui cromosomi aveva mostrato che ognuno di questi organelli, oltre a contenere i geni sede dell'informazione genetica, presentano particolari regioni che sono di fondamentale importanza nel funzionamento dei cromosomi.

1) Il centromero, che svolge un ruolo critico durante la divisione nucleare.
2) I telomeri sequenze speciali che marcano le estremità delle molecole di DNA cromosomale.
3) Una o più origini di replicazione da dove inizia la sintesi di nuovo DNA quando il cromosoma si divide.

In uno YAC, le sequenze di DNA che rappresentano questi componenti del cromosoma sono associate ad uno o più marcatori di selezione e ad almeno un sito di restrizione grazie al quale può essere inserito il nuovo DNA. Queste componenti del cromosoma possono essere contenute in una molecola di DNA lunga 10-15 kb. Dal momento che i cromosomi naturali di lievito vanno da 230 kb a più di 1700 kb, uno YAC avrebbe la potenzialità di clonare frammenti di DNA di dimensioni dell'ordine di una Mb (cioè 1.000.000 di basi). Atualmente la capacità massima è di 1400 kb. Attualmente quest è la capacità massima conosciuta per questi vettori.

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